Bereits Ende der 1920er Jahre gab Margaret Rutherford ihr professionelles Bühnendebüt mit kleineren Parts, ihr Talent wurde jedoch erst relativ spät erkannt, als sie im Januar 1939 am Londoner "Globe Theatre"²⁾ die Haushälterin Miss Prism in dem Oscar Wilde-Klassiker "The Importance of Being Earnest"²⁾ interpretierte. Weitere erfolgreiche Auftritte an Londoner Bühnen schlossen sich an, so folgte ab April 1940 am "Queens Theatre" die Figur der Hausdame Mrs. Danvers in "Rebecca" nach dem gleichnamigen Roman²⁾ von Daphne du Maurier, ab Juli 1941 die der Madame Arcati in Noël Cowards Komödie "Blithe Spirit" (dt. Fröhliche Geister) am "Picadilly Theatre"; einige dieser Stücke wurden später mit Margaret Rutherford verfilmt.
1936 trat sie erstmalig auf der Leinwand als Miss Butterby in "Dusty Ermine" auf und ab Ende der 1930er Jahre wuchs ihre Popularität. Die Komödiantin überzeugte durch unnachahmliches Timing und große Selbstsicherheit. Mit ihrem bemerkenswerten zerfurchtem Gesicht verkörperte sie häufig die exzentrische englische alte Jungfer, so etwa in der Ealing Comedy "Passport to Pimlico" (1949, Blockade in London). Sie spielte hier einfach hinreißend die enthusiastische Mittelalter-Expertin Prof. Hatton-Jones, die den Nachweis führen will, dass der Londoner Stadtteil Pimlico eigentlich zu Frankreich gehört.
Mehrfach verkörperte die Rutherford auch ihre Theaterrollen auf der Leinwand, wie die Madame Arcati in David Leans Film-Version von dem Noël Coward-Stück "Blithe Spirit"²⁾ (1944, Geisterkomödie) oder die Miss Witchurch in Frank Launders "The Happiest Days of Your Life" (1950, Das doppelte College). 1952 mimte sie dann auch noch einmal in Anthony Asquiths Film-Version von " The Importance of Being Earnest"²⁾ (Ernst sein ist alles) die Figur der Miss Prism. In der herrlichen Komödie "On the Double"²⁾ (1961, General Pfeifendeckel) taucht sie neben Protagonist Danny Kaye als Lady Vivian auf, 1963 erhielt Margaret Rutherford einen Oscar als "Beste Nebendarstellerin" für ihre Rolle der verarmten Herzogin von Brighton in dem ebenfalls von Anthony Asquith inszenierten Melodram "The V.I.P.s"²⁾ (Hotel International), einem Film über Passagiere, die wegen Nebels auf dem Londoner Flughafen eine Nacht im Hotel verbringen müssen. Weitere Auszeichnungen für diese brillante Darstellung waren ein "Golden Globe", ein "Laurel Award" und der Preis des amerikanischen "National Board of Review".

MGM nutzte zwischen 1961 und 1965 ihre internationale Bekanntheit und drehte vier Agatha-Christie-Filme mit der Rutherford als Miss "Jane" Marple, die besonders in Europa überaus erfolgreich wurden und ihren Namen mit "Miss Marple" gleichsetzten. 1961 erschien die schrullige Amateurdetektivin erstmals in "16 Uhr 50 ab Paddington"²⁾ (Murder, She Said) auf der Leinwand, 1963 folgte "Der Wachsblumenstrauß"²⁾ (Murder At The Gallop) und 1964 die beiden Filme "Vier Frauen und ein Mord"²⁾ (Murder Most Foul³⁾) sowie "Mörder Ahoi"²⁾ (Murder Ahoy³⁾). In allen vier Filmen war ihr Ehemann Stringer Davis²⁾ (1899 – 1973), den sie 1945 geheiratet hatte, als liebenswerter Assistent "Mr. Stringer" ihr Partner.
Danach stand die Mimin noch für wenige Kinoproduktionen vor der Kamera, so als Miss Gaulswallow neben Marlon Brando und Sophia Loren in der von Charles Chaplin inszenierten Komödie "Die Gräfin von Hongkong"²⁾ (1967, A Countess from Hong Kong), mit einer Gastrolle in "Die Morde des Herrn ABC"³⁾(1964, The Alphabet Murders) und letztmalig als Prinzesssin Ilaria in der heiteren Geschichte "Arabella" (1967) mit Virna Lisi und James Fox.